Voltar a: Biologia – 11ºAno
Ficha n.º 3 – Replicação do DNA – Amplificação de DNA pela reação em cadeia da DNA polimerase (PCR)
Em 1983, um químico com doutorado em bioquímica chamado Karry Mullis desenvolveu uma técnica de multiplicação de moléculas de DNA em laboratório denominada reação em cadeia da polimerase (PCR), baseando-se no processo celular de duplicação de DNA. O método de PCR é considerado uma das grandes invenções da Ciência, sendo uma das técnicas mais realizadas em laboratórios de biologia molecular. Nas reações de PCR, a enzima DNA polimerase normalmente utilizada é proveniente da
bactéria termófila Thermus aquaticus, espécie coletada pela primeira vez em géiseres e fontes termais do Parque Nacional de Yellowstone, nos Estados Unidos. A enzima é denominada Taq DNA polimerase (iniciais do género e espécie da bactéria), apresenta temperatura ótima de atividade a 72°C e permanece ativa (não desnatura) nas altas temperaturas que a PCR atinge. As três etapas da PCR são repetidas, geralmente, de 20 a 30 ciclos. A cada ciclo ocorre a duplicação das moléculas de DNA, determinando, dessa forma sua multiplicação in vitro. A PCR é realizada em um equipamento denominado termociclador, que permite variações de temperatura de forma rápida. No termociclador são colocados microtubos contendo os reagentes necessários para que ocorra a reação enzimática. As reações incluem água ultrapura, moléculas de DNA a serem duplicadas (DNA molde), desoxirribonucleotídeos, primers, enzima DNA polimerase, solução de cloreto de magnésio (cofator da enzima DNA polimerase) e solução tampão para a DNA polimerase.
Figura 1 – Amplificação de DNA pela reação em cadeia de DNA polimerase.
1. Explique a necessidade da utilização de uma solução tampão na técnica de PCR.
- Tópico 1: referência à necessidade de atuação da DNA polimerase para a replicação do fragmento de DNA a ser amplificado.
- Tópico 2 : referência a que a atividade enzimática é influênciada pelo ph do meio.
- Tópico 3 : referência à necessidade de um ph ótimo (solução tampão) para a atuação da DNA polimerase.
2. A molécula de DNA corresponde a um polímero de _________. Cada monómero é constituído por _______.
(A) ribonucleótidos …….. um fosfato, uma desoxiribose, uma base azotada.
(B) ribonucleótidos …….. um fosfato, uma ribose, uma base azotada.
(C) desoxirribonucleótidos …….. um fosfato, uma desoxiribose, uma base azotada.
(D) desoxirribonucleótidos …….. um fosfato, uma ribose, uma base azotada.
- Opção (C)
⇒ A molécula de DNA é constituída por duas cadeias polidesoxirribonucleotídicas. Cada desoxirribonucleótido é constituído por um grupo fosfato, uma pentose (desoxirribose) e uma base azotada (adenina, timina, guanina ou citosina).
3. A enzima Taq DNA polimerase é extraída de um organismo _________. Neste organismo, o DNA encontra-se _______.
(A) procarionte ……………….. no núcleo.
(B) procarionte ……………….. no citoplasma.
(C) eucarionte ……………….. no citoplasma.
(D) eucarionte ……………….. no núcleo.
- Opção (B)
⇒ A enzima Taq polimerase é extraída de uma bactéria. As bactérias são organismos procariontes. O material genético bacteriano localiza-se no citoplasma e é denominado de nucleoide.
4. O aquecimento do material genético enfraquece e quebra as ligações ________, levando à desnaturação do DNA. O inverso denomina-se renaturação, e implica _______ da temperatura.
(A) pontes de hidrogénio ………….. um aumento
(B) pontes de hidrogénio ………….. uma diminuição
(C) fosfodiéster ………….. um aumento
(D) fosfodiéster ………….. uma diminuição
- Opção (B)
⇒ Na técnica de PCR o aumento da temperatura para 95º C permite quebrar as ligações pontes de hidrogénio e assim separar as duas cadeias da molécula de DNA. Para restabelecer as ligações – renaturação – diminui-se a temperatura.
5. De forma distinta da molécula de DNA, o RNA apresenta ______.
(A) maior estabilidade química
(B) razão de A+U e C+G variável
(C) cadeia simples de desoxirribonucleótidos sintetizados de 5′ → 3′
(D) igual percentagem de adeninas e timinas
- Opção (B)
⇒ O RNA apresenta uma estrutura em cadeia simples sendo constituído por uma única cadeia polirribonucleotídica (elimina a opção C) , apresentado menor estabilidade química do DNA, uma vez que é uma molécula temporária (elimina a opção A). No RNA não existe timina (elimina a opção D). No RNA a razão entre A+U e C+G é variável.
6. As enzimas são moléculas que à semelhança do DNA e RNA reagem ao aumento da temperatura. As enzimas são polímeros de _____e nos eucariontes _____.
(A) aminoácidos ….. tornam-se funcionais ao nível do complexo de Golgi.
(B) nucleótidos ….. tornam-se funcionais ao nível do RER.
(C) aminoácidos…… são sintetizadas ao nível do complexo de Golgi.
(D) nucleótidos ….. são sintetizados ao nível do RER.
- Opção (A)
⇒ As enzimas são proteínas. As proteínas são constituídas por aminoácidos. A síntese de proteínas nos eucariontes ocorre ao nível dos ribossomas localizados na face externa do RER. Depois de produzidas, as proteínas migram para o complexo de Golgi onde se tornam funcionais.
7. Numa determinada molécula de DNA foram quantificados 28% de nucleótidos de Timina. Será de esperar que à percentagem de bases pirimidícas nessa molécula corresponda ______.
(A) 28%
(B) 22%
(C) 50%
(D) 100%
- Opção (C)
⇒ No DNA, a quantidade de bases púricas (A+G) é igual à quantidade de bases pirimidicas (T+C), assim se a molécula apresentar 28% de timina, apresentará 28% de adenina, 22% de guanina e 22% de citosina. Logo, a quantidade de timina mais citosina será de 50%.
8. A replicação da molécula de DNA ocorre de modo _______. Será de esperar que ao fim de 4 ciclos de replicação se obtenham ______.
(A) conservativo …….. 8 moléculas de DNA.
(B) conservativo…….. 16 moléculas de DNA
(C) semi-conservativo…….. 16 moléculas de DNA
(D) semi-conservativo …….. 8 moléculas de DNA.
- Opção (C)
⇒ A replicação de DNA ocorre de modo semi-conservativo, pois a partir de uma molécula de DNA mãe são produzidas duas moléculas de DNA filhas iguais entre si e iguais à molécula que as originou. Cada uma das moléculas filhas, apresenta uma cadeia da molécula mãe e uma cadeia nova formada por complementaridade usando nucleótidos livres existentes no meio. Ao fim de 8 ciclos de replicação obtêm-se 16 moléculas de DNA.
9. Na cadeia molde de DNA, a base complementar à timina é________.
(A) a guanina
(B) o uracilo
(C) a citosina
(D) a adenina
- Opção (D)
⇒ No DNA, a base complementar à adenina é a timina e a base complementar à guanina é a citosina.
10. No DNA, o número de _____.
(A) grupo fosfato é igual ao número de bases azotadas.
(B) nucleótidos de timina iguala o número de nucleótidos de citosina.
(C) grupos fosfato é igual ao número de nucleótidos de uracilo.
(D) nucleótidos de guanina iguala o número de nucleótidos de adenina.
- Opção (A)
⇒ No DNA, cada nucleótido é constituído por um grupo fosfato, uma pentose e uma base azotada, logo o número de gruposfosfato é igual ao número de pentoses e igual ao número de bases azotadas. No DNA o número de nucleótidos de timina é igual ao número de nucleótidos de adenina e o número de nucleótidos de guanina igual ao número de nucleótidos de citosina.
11. O produto da replicação de um fragmento de DNA com a seguinte sequência de nucleótidos 3`GCACGTACCCCC5`corresponderá a __________.
(A) 5`CGTGCATGGGGG 3`
(B) 5`CGUGCAUGGGGG 3`
(C) 3` CGTGCATGGGGG 5`
(D) 3` CGUGCAUGGGGG 5`
- Opção (A)
⇒ Como as duas cadeias da molécula de DNA são complementares (a adenina é complementar à timina e a guanina é complementar à citosina) e antiparalelas, logo a cadeia complementar a 3GCACGTACCCCC5, deverá ser 5`CGTGCATGGGGG 3` .
12. Ordene as letras de A a H, de modo a estabelecer a sequência cronológica dos acontecimentos que ocorrem durante o primeiro ciclo de replicação, na técnica de PCR.
A. Formação de duas novas moléculas de DNA
B. Cadeias polinucleotídicas separam-se em determinados locais da molécula.
C. Aumento da temperatura do termociclador para 95º C.
D. Nucleótidos livres estabelecem ligações de hidrogénio com nucleótidos complementares da cadeia original
E. Diminuição da temperatura do termociclador para 55º C.
F. Acomplamento dos primers a cada uma das cadeias polinucleotídicas.
G. Moléculas de DNA polimerase ligam-se a ambas as cadeias polinucleotídicas originais.
H. Aumento da temperatura do termociclador para 72º C.
- C- B-E-F-H-G-D-A
13. Faça corresponder a cada uma das afirmações da coluna A, a respetiva designação que consta da coluna B.
| Coluna A | Coluna B |
|
(a) Conjunto formado pelo DNA e histonas que se encontra no nucleoplasma. (b) Unidade constituída por um núcleo central de histonas, em volta do qual o DNA se enrola duas vezes. (c) Polímero de aminoácidos responsável pela adição de desoxirribonucleótidos livres existentes no meio. (d) Região do cromossoma onde se verifica uma forte ligação entre os seus cromatídeos. (e) Estrutura dispersa no hialoplasma e que contém a informação genética. |
1. Nucleóide 2. Cromatina 3. Nucléolo 4. Nucleossoma 5. Centrómero 6. Cromatídeo 7. DNA polimerase 8. Nucleótido |
- (a) ⇒ 2;
- (b) ⇒ 4;
- (c) ⇒ 7;
- (d) ⇒ 5;
- (e) ⇒ 1 .
